1.2.3培養(yǎng)液殘留原油的提取、純化和鑒定

采用重量法測(cè)定培養(yǎng)液中殘留原油。取培養(yǎng)液使用正己烷萃取至清澈，合并有機(jī)相，40℃減壓蒸餾除去正己烷得到原油，轉(zhuǎn)移至稱量瓶中氮?dú)獯蹈珊蠓Q取原油質(zhì)量。然后稱取約0.1g剩余原油通過(guò)硅膠柱層析，參考美國(guó)EPA.8270E(SW-846)方法進(jìn)行柱層析分離飽和烴和不飽和烴組分，利用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(TSQ8000Evo美國(guó)ThermoScientific公司)分別測(cè)定飽和烷烴(包括姥鮫烷、植烷)和多環(huán)芳烴組分含量，方法為:取烷烴和芳烴洗脫液利用GC-MS測(cè)定，載氣為He，載氣流速1.0 mL/min;無(wú)分流自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL;升溫程序?yàn)?0℃保持2min，以6℃/min升溫至300℃，保持15 min;進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為280和300℃;質(zhì)譜檢測(cè)器采用EI離子源;離子源溫度為230℃;定量采用SIM掃描方式。

依據(jù)公式(1)計(jì)算石油烴降解率:

式中:m0表示對(duì)照培養(yǎng)液中殘余油含量(g·L-1);m1表示實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中殘余油含量(g·L-1)。

1.2.4槐糖脂的提取、純化和鑒定

將培養(yǎng)10d后的發(fā)酵液經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取兩次合并有機(jī)相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A上海亞榮生化儀器)40℃減壓蒸餾除去乙酸乙酯得到黃色粗提產(chǎn)物。粗提產(chǎn)物用薄層層析(TLC)進(jìn)行初步定性分析，以本實(shí)驗(yàn)室由S.bombicola發(fā)酵生產(chǎn)純化后的槐糖脂純品為標(biāo)準(zhǔn)樣。展開(kāi)劑為氯仿/甲醇/水(65∶15∶2，體積比)。顯色劑為苯酚-硫酸試劑，在105℃顯色5 min，糖類顯棕色斑點(diǎn)。

所提取的產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，簡(jiǎn)述如下:取3.0g層析硅膠在110℃的溫度下活化4h后，填充到玻璃層析柱中(頂部加入1cm無(wú)水硫酸鈉)，取0.05~0.1g粗產(chǎn)品溶于2 mL乙酸乙酯/甲醇(10∶1，體積比)混合溶劑中，用40 mL上述混合溶劑洗脫，再通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)相得到槐糖脂純化品。采用高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(1290 HPLC-BrukermaXis Q-TOF美國(guó)Agilent公司)測(cè)定純化品槐糖脂同系物的組分，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH130C182.1mm×150 mm×1.7μm。實(shí)驗(yàn)條件:流動(dòng)相A:V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=0.1∶1.0∶99.0;流動(dòng)相B:V(甲酸)∶V(乙腈)=0.1∶100.0;流速為0.2 mL/min。等度洗脫條件為:流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)為80%。柱溫:30℃，進(jìn)樣量:1μL，UV檢測(cè)波長(zhǎng):207nm，無(wú)分流進(jìn)入質(zhì)譜。質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式;掃描范圍m/Z:200~1000;毛細(xì)管電壓:4.5kV;噴霧氣壓10342.5 Pa;干燥氣(N2)流速:6L/min;氣體溫度:80℃;分辨率:50000。

1.2.5菌體細(xì)胞電子顯微鏡觀察

通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)觀察不同培養(yǎng)階段S.bombicola細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。在培養(yǎng)第1天和第10天時(shí)分別移取添加原油濃度為0.5%的發(fā)酵液約10mL，在3500r·min-1，4℃條件下離心15 min后收集菌體。依次用2.5%的戊二醛和1%的四氧化鋨固定，30%~100%的乙醇系列脫水，然后用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片，經(jīng)醋酸鈾，檸檬酸鉛雙染色后用TEM觀察結(jié)構(gòu)變化。

2結(jié)果與討論

2.1菌株O-13-1對(duì)采油廢水中石油烴的降解作用

在10d的降解時(shí)間內(nèi)，接種S.bombicola的降解體系中油污染物被充分乳化分散為小油珠，培養(yǎng)液顏色明顯加深，而未接種O-13-1菌株的對(duì)照培養(yǎng)體系原油仍呈塊狀漂浮于培養(yǎng)液表面。圖1表示不同初始油濃度下經(jīng)10d降解后的剩余原油量和原油降解率，結(jié)果表明，在10d的降解時(shí)間內(nèi)，與空白對(duì)照相比，油濃度為0.3%、0.5%和0.8%的廢水中油污染物降解率分別提高了18.0%、16.9%和11.9%，這表明所接種的S.bombicola菌株對(duì)廢水中原油有明顯的強(qiáng)化降解作用，且隨廢水中油濃度的降低，生物降解率逐漸提高，這與Rahman等的研究結(jié)果基本一致。這可能是由于油濃度過(guò)高，對(duì)降解菌細(xì)胞具有一定的毒性，降解菌需要較長(zhǎng)的時(shí)間適應(yīng)調(diào)整。

正構(gòu)烷烴的中等碳數(shù)(C17—C28)組分降解率變化趨勢(shì)如圖2所示。接種S.bombicola的培養(yǎng)體系中各組分下降明顯。油濃度為0.8%、0.5%和0.3%的降解體系中正構(gòu)烷烴降解率分別為7.0%~12.8%、17.9%~44.0%和4.5%~27.7%，表明S.bombicola可對(duì)原油中正構(gòu)烷烴組分進(jìn)行生物降解。實(shí)際上，已有研究表明，S.bombicola可高效降解石油烴中的烷烴類組分。在降解過(guò)程中，原油首先被吸附于菌細(xì)胞表面。

圖1不同初始油濃度下經(jīng)10d培養(yǎng)后剩余原油含量和原油降解率的變化

圖2油濃度為0.8%(a)、0.5%(b)和0.3%(c)的培養(yǎng)體系中正構(gòu)烷烴的中等碳數(shù)組分降解率