2結(jié)果與討論

2.1不同細(xì)胞骨架蛋白抑制劑對細(xì)胞表面張力影響的比較

實(shí)驗中，分別單獨(dú)加入骨架蛋白抑制劑2μmol/L CD和30μmol/L blebbistatin，再同時加入2μmol/L CD和30μmol/L blebbistatin。各組細(xì)胞處理15～20 min后進(jìn)行細(xì)胞表面張力測量。利用公式(1)計算細(xì)胞表面張力，實(shí)驗結(jié)果見表1。

各組細(xì)胞的表面張力γ經(jīng)過OriginPro 8.0統(tǒng)計，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。對處理組與對照組細(xì)胞表面張力γ進(jìn)行t檢驗，經(jīng)過相關(guān)性統(tǒng)計分析，均有顯著性差異(P<0.05)。

可以看到，不同細(xì)胞骨架蛋白抑制劑對細(xì)胞表面張力均有顯著影響，處理組細(xì)胞表面張力較對照組顯著降低。其中經(jīng)過CD處理細(xì)胞的下降幅度最大，較對照組降低約87%，顯示肌動蛋白骨架網(wǎng)絡(luò)是NRK細(xì)胞表面張力的最重要影響因素；經(jīng)過blebbistatin處理后的細(xì)胞表面張力約為對照組細(xì)胞的60%，反映出肌球蛋白II分子馬達(dá)活性的維持對細(xì)胞表面張力的影響程度，表明細(xì)胞內(nèi)主動性運(yùn)動的抑制對于細(xì)胞整體的力學(xué)特性有直接的影響。經(jīng)過blebbistatin處理后的細(xì)胞表面張力是CD處理后的2.5倍左右，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示兩者之間有顯著性差異(P<0.05)。在CD和blebbistatin同時作用下，細(xì)胞的表面張力降低大約70%，與blebbistatin或CD單獨(dú)作用下的數(shù)據(jù)有顯著性差異(P<0.05)，但是可以看出CD和blebbistatin同時作用下細(xì)胞表面張力降低的效果不是簡單的線性關(guān)系。

結(jié)果一方面說明了blebbistatin對細(xì)胞表面張力的作用有其獨(dú)立性，另一方面說明肌動蛋白與肌球蛋白II的ATP酶活性之間有著緊密而又復(fù)雜的聯(lián)系，值得進(jìn)一步研究。

2.2抑制單側(cè)子細(xì)胞極區(qū)肌動蛋白聚合對間橋變形的影響

在分裂溝內(nèi)陷出現(xiàn)后，利用5μmol/L CD抑制單側(cè)子細(xì)胞極區(qū)皮層肌動蛋白聚合，采用單側(cè)極區(qū)加入不含CD但是含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%DMSO的培養(yǎng)液作為對照組，并且利用整體blebbistatin處理細(xì)胞，在抑制收縮環(huán)主動性收縮的狀態(tài)下，向單側(cè)極區(qū)加入CD作對比。局部抑制劑作用下的細(xì)胞變形如圖4所示。在內(nèi)陷發(fā)生之后，在正常或整體施加blebbistatin的實(shí)驗條件下抑制單側(cè)極區(qū)肌動蛋白裝配，均不能阻止胞質(zhì)分裂進(jìn)程，各組細(xì)胞都能完成分裂。表明在胞質(zhì)分裂內(nèi)陷發(fā)生后，極區(qū)皮層肌動蛋白的異常裝配不會抑制胞質(zhì)分裂，細(xì)胞胞質(zhì)分裂進(jìn)程持續(xù)進(jìn)行。在這種狀態(tài)下，我們運(yùn)用分析手段去進(jìn)一步研究單側(cè)極區(qū)子細(xì)胞表面張力對胞質(zhì)分裂中細(xì)胞變形的影響，以此了解胞質(zhì)分裂進(jìn)程中胞漿流動和皮層力學(xué)特性之間的聯(lián)系。

圖4局部抑制劑作用下的細(xì)胞變形過程

分別測量三組細(xì)胞胞質(zhì)分裂進(jìn)程中分裂溝間橋的長度和直徑，獲得每組細(xì)胞的D?位置，做出細(xì)胞分裂溝間橋相對直徑對時間的變化曲線，見圖5。

可以看出，對照組細(xì)胞單側(cè)極區(qū)CD處理之后的間橋變形趨勢(圖5-c)與未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞(圖5-a)相似，但是細(xì)胞間橋直徑的變化曲線不平滑，并且在D?點(diǎn)之后相對直徑維持在1附近。結(jié)果表明細(xì)胞間橋的變形在單側(cè)極區(qū)肌動蛋白受抑制情況下因兩側(cè)子細(xì)胞表面張力的不平衡而反復(fù)波動，間橋直徑在D?之后即0～200 s間的相對穩(wěn)定可能是由于細(xì)胞在此處不斷調(diào)節(jié)整體表面張力引起的，隨著胞質(zhì)分裂進(jìn)行，兩極表面張力也逐步調(diào)節(jié)至相似水平。依據(jù)趨勢圖(圖5-c)我們認(rèn)為：兩個子細(xì)胞和整個細(xì)胞表面張力的調(diào)節(jié)是細(xì)胞完成分裂的必需步驟，在細(xì)胞整體的表面張力沒有平衡之前，細(xì)胞間橋的收縮速率會不斷調(diào)節(jié)，甚至維持在一定范圍震蕩。

從整體施加blebbistatin的細(xì)胞組可以看出，單側(cè)利用CD處理的實(shí)驗組細(xì)胞與對照組細(xì)胞的細(xì)胞間橋變形趨勢間出現(xiàn)了差異。在整體存在blebbistatin的狀態(tài)下，同時局部利用CD處理極區(qū)皮層會導(dǎo)致細(xì)胞間橋變形近似一條直線(圖5-d)，而只采用整體blebbistatin處理的細(xì)胞在D?點(diǎn)之前表現(xiàn)出典型的指數(shù)衰減(圖5-b)。這是由于經(jīng)過兩種抑制劑的共同作用，在降低整體表面張力的基礎(chǔ)上大幅降低了單側(cè)子細(xì)胞的表面張力，使得細(xì)胞間橋變形近似于彈性松弛模型，該模型描述的是由細(xì)胞膜的粘彈性和皮層張力決定、由細(xì)胞內(nèi)拉普拉斯壓力差主導(dǎo)的細(xì)胞間橋變形，表現(xiàn)為線性變化。與對照組細(xì)胞單側(cè)極區(qū)施加CD(圖5-c)相比，整體施加blebbistatin并且進(jìn)行抑制單側(cè)極區(qū)肌動蛋白的細(xì)胞(圖5-d)同樣表現(xiàn)出間橋變形曲線不平滑，但是在D?點(diǎn)之后并未出現(xiàn)一段明顯的平穩(wěn)期。Ren等的報道認(rèn)為細(xì)胞感受和傳遞力學(xué)信號主要通過肌球蛋白II與肌動蛋白交聯(lián)蛋白的相互作用，這與本實(shí)驗的結(jié)果相符，我們認(rèn)為這與低活性肌球蛋白II的ATP酶對細(xì)胞肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

圖5 NRK細(xì)胞間橋相對直徑隨時間變化曲線

利用公式2通過OriginPro 8.0軟件對NRK細(xì)胞間橋動力學(xué)進(jìn)行模擬得到的曲線見圖6。可以得出，表面張力取正常細(xì)胞1/10的理論曲線與整體blebbistatin處理組細(xì)胞D?點(diǎn)之前近似，而取正常細(xì)胞1/1000的理論曲線與整體施加blebbistatin并且同時抑制單側(cè)極區(qū)皮層肌動蛋白聚合的曲線近似。

實(shí)驗和模擬結(jié)果顯示，細(xì)胞表面張力的變化深刻影響著胞質(zhì)分裂進(jìn)程中細(xì)胞間橋的變形。我們之前的實(shí)驗表明，經(jīng)過blebbistatin整體處理后的細(xì)胞，其間橋變形D?點(diǎn)之前與γ=0.015 nN/μm的模擬曲線較吻合，與正常細(xì)胞和單側(cè)子細(xì)胞CD處理后的正常細(xì)胞差異明顯，說明表面張力和分裂溝主動收縮共同影響間橋變形。另一方面，整體blebbistatin和局部CD共同作用下的細(xì)胞顯示了與其它各組不同的變化趨勢，其變形曲線近似為線性，這與彈性松弛變形的曲線相似，也與間橋變形動力學(xué)模型中當(dāng)表面張力接近0的情況相近，結(jié)果顯示在去除分裂溝主動收縮的條件下，細(xì)胞表面張力直接決定著細(xì)胞間橋變形。

3結(jié)論

本實(shí)驗在測定骨架蛋白抑制劑作用下細(xì)胞表面張力變化的基礎(chǔ)上，對兩側(cè)子細(xì)胞表面張力不平衡狀態(tài)下的細(xì)胞間橋變形進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果顯示，在胞質(zhì)分裂的細(xì)胞力學(xué)變形過程中，極區(qū)子細(xì)胞表面張力的變化與細(xì)胞分裂溝間橋的變化有著密切的聯(lián)系。抑制單側(cè)極區(qū)皮層肌動蛋白聚合降低了處理區(qū)域子細(xì)胞的表面張力，由此導(dǎo)致的兩極子細(xì)胞表面張力不平衡能夠引起細(xì)胞間橋變形進(jìn)程的異常。正常細(xì)胞的單側(cè)極區(qū)肌動蛋白聚合受到抑制可以導(dǎo)致細(xì)胞間橋變形的停滯；對于經(jīng)過blebbistatin處理而喪失收縮環(huán)主動性收縮的細(xì)胞，極區(qū)細(xì)胞皮層表面張力對細(xì)胞間橋的變形趨勢起主導(dǎo)作用。本文得到的實(shí)驗結(jié)果為研究細(xì)胞如何通過調(diào)節(jié)自身各區(qū)域力學(xué)特性從而引導(dǎo)胞質(zhì)分裂的變形提供了基礎(chǔ)實(shí)驗依據(jù)。分裂細(xì)胞的力學(xué)變形過程與細(xì)胞在時間和空間上調(diào)節(jié)自身力學(xué)特性的聯(lián)系，是我們今后研究的重點(diǎn)。